原位雜交-思特進(jìn)科技發(fā)展公司

使用分支DNA信號(hào)擴(kuò)增的RNA FISH

Invitrogen? ViewRNA?和PrimeFlow?檢測是使用分支DNA信號(hào)擴(kuò)增 (bDNA) 來檢測特異性信號(hào)的直接熒光RNA ISH方法。 使用獨(dú)立但兼容的信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)讓RNA靶標(biāo)的多重復(fù)用成為可能。 熒光RNA原位雜交檢測分為四個(gè)主要步驟：樣本制備、靶標(biāo)雜交、信號(hào)擴(kuò)增以及檢測。 該方法可實(shí)現(xiàn)更高的特異性，更低的背景值和更高的信噪比。

雜交技術(shù)zui重要的因素之一是選擇zui適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即zui適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對(duì)雜交的影響見表18-3。

zui適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature， TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)

原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（In situ hybridization， ISH）是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織細(xì)胞內(nèi)待測的核酸，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，原位雜交，然后用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，通過組織化學(xué)或免3疫組織化學(xué)方法在核酸原有位置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位、定性和定量研究。為分子水平研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及有關(guān)細(xì)胞5因子的調(diào)控提供了有效的工具?？梢暈榻M織化學(xué)與免3疫組織化學(xué)的重大突破。

原位雜交不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保護(hù)組織和細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。

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