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在real-time Q-PCR技術中，無論是相對定量還是標準曲線定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的問題有待解決。在標準曲線定量中，標準品的制備是一個必不可少的過程。目前由于無一統(tǒng)一標準，各個實驗室所用的生成標準曲線的樣品各不相同，致使實驗結(jié)果缺乏可比性。廣州勱博--屠宰場熒光定量PCR擴增序列特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物，它又可分為直接法和間接法。此外，用real-time Q-PCR來研究mRNA時，受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄（RT）效率的限制。在相對定量中，其前提是假設內(nèi)源控制物不受實驗條件的影響的，合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內(nèi)源控制物也是實驗結(jié)果可靠與否的關鍵。

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與傳統(tǒng)的PCR技術相比，Real-time Q-PCR的不足之處是：（1）由于運用了封閉的檢測，減少了擴增后電泳的檢測步驟，因此也就不能監(jiān)測擴增產(chǎn)物的大小；廣州勱博--冷凍食品加工企業(yè)/公司/廠核酸提取純化QF-PCR技術在國外已有較廣泛的應用，但目前尚未在國內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床中普遍開展。（2）因為熒光素種類以及檢測光源的局限性，從而相對地限制了real-time Q-PCR的復合式（multiplex）檢測的應用能力；（3）目前real-time Q-PCR實驗成本比較高，從而也限制了其廣泛的應用。

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熒光定量PCR技術產(chǎn)生并成熟于上世紀90年代，由于該技術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應的全過程進行實時監(jiān)控，并且自動化程度高，所以該技術從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時間，在科研及檢驗領域獲得了廣泛的應用，成為分子生物學領域不可或缺的一項重要技術。熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號隨著PCR反應的積累來實時監(jiān)控PCR反應的進程，并通過分析軟件對PCR的反應進行檢測分析的技術。其原理：隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。系統(tǒng)組成：定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。

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進行熒光定量PCR體系的配制時i好在冰上進行，操作環(huán)境不用非得在超凈臺中進行，環(huán)境安靜整潔都可以。因為每一個梯度要做三個重復，因此先在1ml的無菌離心管中配制好后再分裝入96孔板中。實驗中我使用過熒光定量八聯(lián)管和96孔板，個人推薦96孔板。因為八聯(lián)管你需要蓋上蓋子，而且蓋子比較的難按下去，稍不慎就把八聯(lián)管弄斷或者液體撒出來。二、應急期間，比對符合要求的檢測試劑盒（試紙條）可使用至2019年6月30日。有的時候一下忘記了是從哪邊開始的。96孔板比較方便，加完樣品后只需附上一層膜，用它自帶的板子撫平即可。上機器前i好離心一下，讓貼在管壁上的液體流下來同時也消掉氣泡。

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一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋， 無法判斷產(chǎn)物量的變化。因為病原體往往附著于其他物質(zhì)上面或中間，消毒i藥與病原接觸需要先滲透，而滲透則需要時間，有時時間會很長。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系，根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值.

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什么是熒光定量PCR？常規(guī)PCR中，擴增產(chǎn)物（擴增子）是通過終點法來分析檢測，即PCR反應結(jié)束后，DNA通過瓊脂糖凝膠電泳，然后進行成像分析。而熒光定量PCR可以在反應進行過程中進行累積擴增產(chǎn)物的分析和檢測，即“實時”。在反應體系中加入熒光分子，通過熒光信號的按比例增加來反應DNA量的增加，使PCR產(chǎn)物的實時檢測成為可能。熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號隨著PCR反應的積累來實時監(jiān)控PCR反應的進程，并通過分析軟件對PCR的反應進行檢測分析的技術。滿足實驗目的的熒光化學物質(zhì)包括DNA結(jié)合染料和熒光標記的序列特異引物或探針；專門的熱循環(huán)儀配備熒光檢測模塊，用于監(jiān)測擴增時的熒光，檢測到的熒光信號反映了每個循環(huán)擴增產(chǎn)物的量。

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根據(jù)動物防疫法及其配套規(guī)章規(guī)定，縣級動物衛(wèi)生監(jiān)督機構依法向屠宰場派駐(出)官i方獸醫(yī)實施屠宰檢疫。在不使用時蓋住接收坑，有效地控制害蟲，防止灰塵收集系統(tǒng)中的灰塵再循環(huán)回到飼料中，并管理好整個工廠的人員移動。按照生豬屠宰檢疫規(guī)程和相關規(guī)定，屠宰檢疫內(nèi)容包括傳i染病和寄i生蟲病，檢疫流程包括生豬進入屠宰廠(場、點)監(jiān)督查驗、檢疫申報、宰前檢查、同步檢疫、檢疫結(jié)果處理以及檢疫記錄等。在非洲防控期間，官i方獸醫(yī)監(jiān)督屠宰企業(yè)開展非洲自檢，對沒有開展自檢的屠宰企業(yè)，對屠宰后的生豬產(chǎn)品一律不得出具動物檢疫證明。

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實時熒光定量PCR(real-time quantitativePCR)/QRT-PCR，是指在PCR反應體系中加入熒光標記物，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過擴增曲線對未知模板進行定量分析的方法。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監(jiān)測反應全過程。一般用于mRNA轉(zhuǎn)錄水平的定量研究、不同樣本或基因組中DNA拷貝數(shù)的測定、基因芯片結(jié)果驗證、藥i效分析等。金開瑞采用SYBR熒光染料法及TaqMan探針法進行熒光定量PCR檢測，從引物設計到檢測一次性完成，提供2種常用的內(nèi)參引物及免費的專業(yè)數(shù)據(jù)分析，每個樣品設置至少三個平行對照，保證結(jié)果的準確可靠。