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雜交條件一般是37℃避光濕盒過夜。至少溫度要嚴格控制在37-40℃,過高或者過低都是不適合的。孵育時間也不要無限延長,一般18-20h就肯定夠了,時間過久會造成自動解鏈,造成信號降低。
漂洗液的溫度控制。很多人都覺得這個無所謂。小編個人認為FISH實驗是一個對溫度非常敏感的實驗。保證漂洗液溫度為37℃而不是室溫,可能對于整個實驗有比較良好的影響。
原位雜交在前。
(1)常規(guī)脫蠟入水。
(2)37℃蛋白酶K消化20min,37℃漂洗液充分洗去蛋白酶K。
(3)滴加探針,加蓋玻片,避光、濕盒、37℃過夜孵育。
(4)如果試劑盒允許的話,將試劑盒中洗脫液水浴加溫至37℃震蕩洗脫多余的探針。
(5)加堿性磷酸酶標記的抗1體,37℃孵育半小時,洗去抗1體后顯色。
免1疫組化在后。
(1)將顯色后確認為陽性的切片充分漂洗。
(2)在PH為6.0的枸櫞酸鈉溶液中,微波至96℃左右,作用10min。
(3)滴加一抗,37℃濕盒孵育2h。
(4)充分漂洗切片,滴加二抗,室溫下孵育40-50min。
(5)DAB顯色后,采用PBS中止顯色反應(yīng)。
(6)不要復(fù)染核,不然就蓋住原位雜交信號了。