IP-WB活性檢測(cè)試劑盒推薦 武漢紐斯特

武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國(guó)生命科學(xué)試劑供應(yīng)商美國(guó)NewEastBio在中國(guó)的子公司。公司位于武漢東湖高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)光谷生物城.美國(guó)NewEastBio專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，主要產(chǎn)品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等，與世界高校和研究所、世界大制藥公司、生物科技公司和醫(yī)院等客戶建立了長(zhǎng)期穩(wěn)定的合作關(guān)系，產(chǎn)品銷往全球。

NewEast Biosciences Arf6激l活檢測(cè)試劑盒基于特定于配置的單克l隆抗l體和Arf6特異性兔多克l隆抗l體，該抗l體特異性識(shí)別Arf6-GTP，但不能識(shí)別Arf6-GDP。 鑒于單克l隆抗l體對(duì)其抗原的高度親和力，可以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行激l活測(cè)定。 該測(cè)定法可提供可靠的結(jié)果，并具有一致的可重復(fù)性。

 1.抗活性的Arl1，小鼠單克l隆抗l體（貨號(hào)26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％疊氮l化鈉。該抗l體特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物的Arl1-GTP。

2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號(hào)30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。

3. 5X測(cè)定/裂解緩沖液（目錄號(hào)30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arl1，小鼠單克l隆抗l體（目錄號(hào)26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（貨號(hào)30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

6. 100 X GDP（產(chǎn)品目錄號(hào)30304）：一個(gè)樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的細(xì)胞裂解液

2.蛋白酶抑制l劑

3. 4°C管搖桿或搖床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化鎂

6. 2倍還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7.電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8.免l疫印跡洗滌緩沖液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％Tween-20）

9.免l疫印跡封閉緩沖液（TBST包含5％脫脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纖維素膜

11.二抗

12. ECL檢測(cè)試劑

?1X測(cè)定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲(chǔ)備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將5X的Assay/Lysis緩沖液稀釋成1X的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制l劑如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。

樣品處理

貼壁細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約80%-90%之間（直徑10 cm培養(yǎng)皿，~107個(gè)細(xì)胞），并用活性劑或抑制l劑進(jìn)行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3. 向細(xì)胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個(gè)直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理10-20分鐘。

5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來(lái)。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，將細(xì)胞裂解物用27?的注射l器針頭來(lái)回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的樣品存放于-70°C條件下。

檢測(cè)步驟

Ι?；钚訡dc42 Pull-Down實(shí)驗(yàn)

1. 等分0.5-1 mL的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 緩沖液。

3. 向管中加入1ul的活性Cdc42單克l隆抗l體。

4. 用渦旋振蕩儀將protein A/G凝膠柱充分混勻，然后快速的吸出20ul懸浮珠漿液加入離心管中。

5. 將管置于4°C條件下孵育1H，并輕輕的進(jìn)行搖動(dòng)。

6. 5000g，離心1分鐘。

7. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

9. 后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2X SDS-PAGE樣品緩沖液重懸樣品。

11. 樣品煮沸5min。

12. 5000g，離心10s。